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本试剂盒采用改良氯化铷法制备高效大肠杆菌感受态细胞，制备步骤和传统的氯化钙法一致，感受态转化效率比氯化钙法高1～2个数量级，可达10⁹以上。本试剂盒通过溶液的优化配比为高效感受态制备提供了一个简单、可靠的方法，试剂盒中提供的BT Media感受态专用培养基进一步提高了感受态转化效率，本试剂盒特别适用于文库转化等对感受态转化效率要求较高的应用。

• 感受态效率极高，可达10⁹ cfu/μg DNA以上。
  
• 制备好的感受态可以直接冻存。
  
• 使用感受态专用培养基，最大化感受态细胞效率。
  
• 适合大量制备。

• 超级感受态细胞制备流程：
  
  • 准备工作：
    
    • 自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、50mL离心管、冰等。
      
    • BT Media培养基准备：1支BT Media加50mL蒸馏水配置，高压灭菌即可。
      
    • 将BT Buffer A和BT Buffer B放冰上预冷，预冷低温离心机至4℃。
  • 操作步骤：
    
    • 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长至直径1～2mm大小。
      
    • 挑取一个生长正常的菌落，接种至10～15mL液体LB培养基中，于37℃摇床充分振荡（≥ 250rpm）培养12～16h。
      
    • 取上述活化好的菌液0.5mL接种至准备好的50mL BT Media中，于37℃摇床充分振荡培养至菌液OD600 = 0.5～0.6。
      
      • 50mL培养物请使用容量大于250mL的锥形瓶，同时摇床转速超过250rpm以保证通气充分。
        
      • 注意监测菌液OD值，培养至OD600为0.5～0.6所需要的时间通常为2～3h。
    • 将菌液转移至50mL聚丙烯塑料离心管中，冰上放置5～10min。
      
      • 请勿将菌液置玻璃锥形瓶中直接放冰上。
    • 于4℃，3500～5000rpm离心5min收集菌体沉淀。
      
    • 每50mL培养物菌体沉淀用16mL冰上预冷的BT Buffer A轻柔充分重悬菌体，冰上放置10～15min。
      
      • 轻轻重悬菌体，避免移液器用力吹打或剧烈振荡。
        
      • 如果使用不同体积的菌液量，请相应改变BT Buffer A和BT Buffer B的用量。
    • 于4℃，3500～5000rpm离心2～5min收集菌体沉淀。
      
    • 每50mL菌体沉淀用4mL冰上预冷的BT Buffer B轻柔充分重悬菌体，按每管100μL分装至冰上预冷的1.5mL离心管中。
      
      • 分装感受态所使用的枪头和离心管均需要预冷，保持在冰上操作。
    • 菌体直接用于转化或用液氮速冻后于超低温冰箱中保存。
      
      • 制备好的感受态可于冰上保存0～48h，-80℃保存有效期为6个月。
• 标准转化步骤：
  
  • 准备工作：
    自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
    调节水浴锅至42℃，将活化用的LB或SOC培养基预热至37℃，将含相应抗生素的平板预热至37℃。
    
  • 操作步骤：
    
    • 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
      
      • 新鲜制备的感受态细胞可以在冰上保存0-48h，直接使用。
    • 每管感受态加入100pg～10ng待转化DNA或连接产物，轻柔混匀，于冰上静置30min。
      
      • DNA体积不超过感受态细胞体积的5%。
        
      • 冰上静置时间少于15min将降低转化效率。
        
      • 此处可设置用无菌水代替DNA进行转化的对照组1（见附录）。
    • 将离心管置42℃水浴锅中孵育45～90sec，取出后立即冰上放置2～3min。
      
      • 热激时请勿搅动。
    • 加入800～900μL预热至37℃的不含抗生素的LB或SOC培养基，颠倒混匀。
      
    • 于37℃摇床缓慢振荡培养45～60min。
      
      • 摇床转速不超过220rpm。
    • 取适量菌液涂布至与目标质粒抗性相应的LB平板中，于37℃培养箱中倒置培养过夜（12-16h）。
      
      • 此处可将菌液涂布一份至不含抗生素的平板上，作为对照组2（见附录）。
        
      • 分别取不同的菌液量，如1～2μL、10～20μL、100～200μL涂布平板以避免转化子太多导致难以挑斑的情况。
        
      • 如果需要进行蓝白斑筛选，在培养基中加入终浓度为40μg/mL的X-gal和1mmol/L的IPTG。
        
      • 使用百奥莱博平板涂布专用玻璃珠(货号：GS0140)进行涂布可以比传统涂布方法获得更多转化子。